使用合适的内参检测放线菌素D的RNA稳定性试验
引言：
放线菌素D（Streptomycesavermitilisavermectin）是由土壤放线菌Streptomycesavermitilis分泌的一类神经活性化合物，其具有广谱杀虫活性和抗寄生虫效果。因此，放线菌素D在农业、医药以及公共卫生领域的应用广泛。
然而，放线菌素D的高效表达和纯化常常受到RNA稳定性的影响。因此，本文旨在探索一种合适的内参在检测放线菌素D的RNA稳定性试验中的应用。
方法：
第一部分：放线菌素D的RNA提取与质量检测
为检测放线菌素D在不同环境条件下的RNA稳定性，首先需对固定条件下采集的细胞进行RNA提取。RNA提取采用QIAGENRNeasyMinikit，光泽度比值A260/A280在1.8~2.1之间，且RNA完整性值（RIN）不低于6.0。其中，质量检测采用NanoDropspectrophotometerND-2000。
第二部分：确定合适的内参
确定合适的内参通常需要从多个常规基因和转录本中筛选。本实验选取GAPDH、β-actin、18SrRNA、eEF2和β-tubulin作为候选内参。首先，用qRT-PCR分别检测各内参基因的表达水平，确定其表达量的变异系数（CV）。其次，利用geNorm软件计算内参基因的稳定性系数（M值），从而确定最稳定的内参。
第三部分：qRT-PCR检测RNA稳定性
在确定最佳内参后，用qRT-PCR检测放线菌素D在不同处理条件下的RNA稳定性。反应包含三个生物学重复，每个重复包括目标基因（放线菌素D）和选择的内参基因，以及一个阴性对照（RT-）和检测放线菌素D人工RNA标准曲线。qRT-PCR反应采用反转录一步法，其体系为SYBRGreenPCRMasterMix（TakaraBio）、RNase-free水、cDNA以及特定引物。实验设计至少包含三重复，每重复包含目标基因和选择的内参基因，RT-和cDNA的阈值与标准曲线比较，计算不同条件下放线菌素D表达量的相对变化量。
结论：
通过本实验的方法，确定了最适合检测放线菌素DRNA稳定性的内参基因。这可以为放线菌素D的高效表达和纯化提供实验支持，同时也为其他RNA稳定性试验提供方法参考。
